3年經(jīng)驗總結！新冠檢測實(shí)驗室，核酸氣溶膠污染避坑指南！
發(fā)布時(shí)間：2022-11-17 09:06:13
核酸檢測實(shí)驗室想完全杜絕核酸污染是不可能的。核酸檢測實(shí)驗室的管理者和實(shí)驗人員必須要認識到核酸污染是不可避免的，但是污染的頻率和概率是可控的。我們要做的是時(shí)刻保持警惕，盡最大努力將污染的概率降到最低，并且能第一時(shí)間發(fā)現污染并及時(shí)進(jìn)行處理。
先說(shuō)說(shuō)有史以來(lái)影響最大的實(shí)驗室核酸污染事件當地時(shí)間２０２０年４月１８日，《華盛頓郵報》（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ?。校铮螅簦┍艘粍t重磅新聞，美國ＣＤＣ在實(shí)驗室生產(chǎn)的新冠病毒檢測試劑出現了污染問(wèn)題，導致全美的核酸檢測推遲最少一個(gè)月。１月２１日，ＣＤＣ已經(jīng)“確定開(kāi)發(fā)”了新冠病毒的檢測方法，并使用它來(lái)確認美國的第一例新冠病例，１月下旬，美國ＣＤＣ對２６個(gè)公共衛生實(shí)驗室發(fā)放新冠病毒試劑盒，有２４個(gè)實(shí)驗室出現了假陽(yáng)性反應。ＣＤＣ緊急召回了診斷試劑，直到３月２日，ＣＤＣ的新冠病毒試劑由Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ?。模危痢。裕澹悖瑁睿铮欤铮纾椋澹?，ＩＤＴ公司生產(chǎn)重新投入使用。這起實(shí)驗室污染的代價(jià)是美國錯過(guò)了黃金的疫情防控窗口，數萬(wàn)甚至數十萬(wàn)普通民眾死亡。每一個(gè)實(shí)驗室都應該把這個(gè)教訓銘記在心，時(shí)刻提醒自己，核酸污染隨時(shí)都可能發(fā)生，無(wú)論什么級別的實(shí)驗室都可能發(fā)生。較常見(jiàn)，發(fā)生概率在４０％～６０％之間；以重組質(zhì)粒作為陽(yáng)性質(zhì)控品，發(fā)生污染的概率更大；以構建的假病毒或重組病毒作為陽(yáng)性質(zhì)控品，參與核酸提取的過(guò)程中，也容易發(fā)生氣溶膠污染；在試劑的配制過(guò)程中，接觸了污染的容器、移液器、槍頭、溶液，核酸氣溶膠等，導致試劑被污染。筆者認為，這是目前實(shí)驗室引起的核酸污染最主要原因！尤其是是第一代ＰＣＲ技術(shù)，發(fā)生概率在６０％以上；ＰＣＲ產(chǎn)物經(jīng)反復多次的擴增，其復制量遠遠超過(guò)ＰＣＲ的檢測極限。
一個(gè)氣溶膠所包含的拷貝數可以在１０４～１０６ｃｏｐｉｅｓ，因此即使是極微量的污染也足以造成實(shí)驗結果假陽(yáng)性。
但是，在采用了ＵＮＧ／ＵＤＧ防污染的ＰＣＲ產(chǎn)品中，擴增產(chǎn)物引起的污染概率降至１０％左右。
ＰＣＲ擴增管的密封性是預防擴增產(chǎn)物污染的關(guān)鍵。如果密封不嚴，擴增完成后有蒸發(fā)現象，液面不整齊，或者擴增過(guò)程中有“炸管”聲音。
放置樣品的容器被污染或由于容器密封不嚴導致樣品與外界接觸被污染；待提取樣本中含有強陽(yáng)性樣本，其提取的樣品中含有高濃度的陽(yáng)性核酸，形成氣溶膠造成污染。氣溶膠是由空氣與液體表面摩擦而產(chǎn)生的。開(kāi)蓋、晃動(dòng)、加樣器的反復抽吸等開(kāi)放式操作，形成核酸氣溶膠從而導致核酸污染。以上核酸污染來(lái)源，均可形成氣溶膠擴散至空氣中，或直接吸附到物體表面。因此，應尤其重視由氣溶膠導致污染的問(wèn)題。重度污染假陽(yáng)性的ｃｔ值可在２４左右，中度污染ｃｔ值在３０左右；輕度污染ｃｔ值在３３左右。從核酸污染的分布來(lái)看主要在２個(gè)地方：１、空氣中的核酸氣溶膠污染物：彌散到實(shí)驗室各個(gè)角落，比較棘手；２、物表的核酸污染物：移液器、離心機、核酸提取儀、傳遞窗、ＰＣＲ儀、拆開(kāi)的試劑盒、槍頭盒、打開(kāi)的耗材等表面。嚴格的ＰＣＲ實(shí)驗室應有標準的正負壓系統及四分區（或三分區），實(shí)驗室應按照生物安全二級實(shí)驗室及ＰＣＲ實(shí)驗室設計基本要求來(lái)建設?？蓞⒖嫉臉藴蕿椤叮牵拢担埃常矗叮玻埃保苯ㄔO標準生物安全實(shí)驗室建筑技術(shù)規范》及衛健委下發(fā)的《醫療機構臨床基因擴增檢驗實(shí)驗室工作導則》。醫療口的實(shí)驗室大多符合要求，在科研口和農業(yè)口的實(shí)驗室應重視實(shí)驗室的規范性建設！軟件配置應按照衛健委相關(guān)技術(shù)文件規定，人員配置應專(zhuān)區專(zhuān)人，人員不可不同分區混用，物流、人流、氣流做到單向流動(dòng)！臨床上，門(mén)診的新冠快檢ＰＣＲ實(shí)驗室（或免提取方法）多半不規范。沒(méi)有嚴格按照標準ＰＣＲ實(shí)驗室建設，更加容易發(fā)生污染。三分區（或二分區）、緩沖間、正負壓、人員配置２人以上，這些基本要求沒(méi)有達到，更加容易發(fā)生氣溶膠污染。現有技術(shù)指導原則，只要求了選擇ＢＳＬ－Ⅱ級生物安全柜，但并未規定具體型號。從臨床經(jīng)驗來(lái)看，只有Ｂ２型生物安全柜可以用于加核酸模板。Ａ１型、Ａ２型、Ｂ１型，循環(huán)風(fēng)很容易造成核酸氣溶膠的形成，從而造成污染，且污染很難清除。Ｂ２型為全排放，無(wú)循環(huán)風(fēng)，可以用于加核酸模板。
紫外燈能殺滅病毒，但是《醫療機構臨床基因擴增檢驗實(shí)驗室工作導則》指出，短片段的基因核酸對紫外線(xiàn)損傷不敏感。常規消毒劑如酒精、碘化物、戊二醛類(lèi)、季銨鹽等雖然能殺菌，但是不能降解核酸，或降解效率較差。尤其是酒精，它其實(shí)是核酸提取試劑中的一個(gè)組分，對核酸沒(méi)有任何降解作用。已知的消毒劑中，次氯酸鹽類(lèi)消毒劑可以一定程度的降解核酸，但是腐蝕性強，不能處理精密儀器及金屬制品，容易腐蝕移液器吸桿影響ｔｉｐ頭氣密性。吸取陽(yáng)性對照（質(zhì)粒）沒(méi)有遵循“慢吸快打”的原則（這個(gè)需要練習形成“肌肉記憶”），新手往往是“快吸快打”，造成陽(yáng)性樣品污染槍頭，或者在生物安全柜循環(huán)風(fēng)的影響下，造成氣溶膠飛濺，污染加樣區域。應使用帶有濾芯的槍頭。
帶濾芯槍頭
４．２ 加樣區沒(méi)有放置臺面垃圾桶：應把加完樣的ｔｉｐ槍頭，丟入含有次氯酸溶液的加蓋垃圾桶中。因為次氯酸容易揮發(fā)，因此應每天都要更換含氯消毒液！
桌面垃圾桶（利器盒）
在筆者的臨床實(shí)踐中，發(fā)現以下區域存在陽(yáng)性污染的概率更大：
生物安全柜＞核酸提取儀＞移液器＞ＰＣＲ擴增儀（ＰＣＲ管密封性）＞離心機；陽(yáng)性質(zhì)控品＞強陽(yáng)性樣本＞ＰＣＲ擴增產(chǎn)物（無(wú)ＵＮＧ技術(shù)）＞ＰＣＲ擴增產(chǎn)物（ＵＮＧ技術(shù)），ＰＣＲ管密封性是擴增產(chǎn)物是否引起污染的關(guān)鍵。如同，幸福的家庭都一樣，不幸的家庭各有各的不幸。同理，規范的實(shí)驗室都一樣，污染的實(shí)驗室各有各染情況。以上數據僅供參考。核酸檢測實(shí)驗室的布局是預防污染的根本，合理布局可以大大降低污染的概率。一般情況分為四個(gè)區分別為試劑準備區，標本制備區、核酸擴增區和產(chǎn)物分析區。對于不需要電泳的熒光定量ＰＣＲ，核酸擴增區和產(chǎn)物分析區可以合并。每個(gè)區應獨立通風(fēng)，可控制空氣流動(dòng)方向。有些核酸檢測實(shí)驗室在實(shí)驗室建設時(shí)未考慮到核酸擴增需求，就是按照普通實(shí)驗室建設。這種情況下，個(gè)人建議擴增和產(chǎn)物分析區應遠離試劑準備區和標本制備區，盡量不在一個(gè)樓層或者不在一個(gè)區域。最忌諱的是幾個(gè)實(shí)驗室緊挨著(zhù)，甚至門(mén)對門(mén)。另外建議廢棄物處理的房間也要遠離以上實(shí)驗室，避免廢棄物處理過(guò)程中產(chǎn)生的污染。四個(gè)隔開(kāi)的工作區域中每一區域都須有專(zhuān)用的儀器設備。各區域都必須有明確的標記，以避免設備物品如加樣器或試劑等從其各自的區域內移出從而造成不同的工作區域間設備物品發(fā)生混淆。在不同的工作區域應使用不同顏色或有明顯區別標志的工作服，以便于鑒別。進(jìn)入各個(gè)工作區域必須嚴格遵循單一方向順序，即只能從試劑貯存和準備區、標本制備區、擴增反應混合物配制和擴增區（簡(jiǎn)稱(chēng)擴增區）至產(chǎn)物分析區，避免發(fā)生交叉污染。再好的實(shí)驗室設計，如果實(shí)驗人員不遵守規程，一切都是徒勞的。加強實(shí)驗室人員的培訓和管理至關(guān)重要。陰性質(zhì)控：實(shí)驗室的核酸污染風(fēng)險跟檢測量正相關(guān)，因此在檢測活動(dòng)比較頻繁時(shí)需要多添加陰性質(zhì)控，包括陰性樣品，陰性提取對照，陰性擴增對照，無(wú)模板對照，甚至可以使用反應體系，引物探針和提取試劑等作為對照以檢驗檢測流程和反應系統組分的污染。陰性對照可以使用幾個(gè)隨機插入檢測樣品。保證出現污染可以第一時(shí)間發(fā)現。陽(yáng)性質(zhì)控：避免或減少使用過(guò)強的質(zhì)粒陽(yáng)性對照。有一些規范建議ＰＣＲ產(chǎn)物使用１ｍｏｌ／Ｌ鹽酸浸泡，我認為這極易造成ＰＣＲ產(chǎn)物的暴露和擴散，具有很高的風(fēng)險。還有一些實(shí)驗室從生物安全的角度將所有的實(shí)驗廢棄物全部高壓，我也是不建議的，因為ＰＣＲ產(chǎn)物沒(méi)有生物安全風(fēng)險，高壓會(huì )造成ＰＣＲ產(chǎn)物擴散，對實(shí)驗室的污染風(fēng)險更高。個(gè)人建議對于ＰＣＲ產(chǎn)物，進(jìn)行表面消毒后按照普通醫療廢棄物處理即可。對于一般的核酸檢測實(shí)驗室，推薦使用封閉擴增的熒光定量ＰＣＲ方法進(jìn)行核酸檢測。不推薦使用普通ＰＣＲ方法和巢氏ＰＣＲ，使用這兩種方法實(shí)驗室污染是大概率事件。謹慎使用等溫擴增的方法，等溫擴增的酶反應效率更高，產(chǎn)物中模板含量也更高，污染的概率也會(huì )提高。操作核酸時(shí)動(dòng)作要輕柔，移液器吸液慢吸慢放，開(kāi)管蓋要慢慢開(kāi)，避免操作產(chǎn)生氣溶膠。使用渦動(dòng)混勻后，稍稍靜置一會(huì )再開(kāi)管蓋，推薦使用移液器緩慢吹吸混勻。其原理是用ｄＵＴＰ 代替ｄＴＴＰ，使產(chǎn)物中摻入大量ｄＵ。在再次進(jìn)行ＰＣＲ 擴增前，用ＵＮＧ 處理ＰＣＲ 混合液即可消除ＰＣＲ 產(chǎn)物的殘留污染。由于ＵＮＧ 在ＰＣＲ 循環(huán)中的變性一步便可被滅活，因此不會(huì )影響含ｄＵ 的新的ＰＣＲ 產(chǎn)物。所有試驗物品盡可能分裝成小包裝：耗材開(kāi)包后分裝成一周使用量，用自封袋封好。試劑也盡可能購買(mǎi)小包裝或者回實(shí)驗室分裝，實(shí)驗中經(jīng)常用到配液的水尤其需要分裝。實(shí)驗中所有吸頭都應使用帶濾芯的吸頭。發(fā)現污染第一步就是要暫停實(shí)驗，評估假陽(yáng)性對以往檢測結果的影響。對實(shí)驗進(jìn)行徹底打掃和清理，盡可能更換相關(guān)的試劑耗材，對儀器設備進(jìn)行清潔和去核酸處理。所有人員回家洗澡換衣服。使用商品化的ＤＮＡ去除劑，有好用的ＤＮＡ去除劑大家可以推薦給我１?。恚铮欤斓摹←}酸和各種化學(xué)物質(zhì)去降解ＤＮＡ。停下所有實(shí)驗，靠風(fēng)和時(shí)間抹掉核酸的痕跡。這是我最常用的方法，通風(fēng)是最有效的方式。如果是擴增產(chǎn)物污染，在不去除污染的情況下仍然可以進(jìn)行檢測。方法是使用另一種方法或試劑盒，只要兩種試劑的擴增產(chǎn)物不一致，沒(méi)有交叉反應，仍然可以繼續試驗。但是這種方法要進(jìn)行測試，我并不推薦這么做。移液器內部被污染很難去除，可以通過(guò)清洗或者另?yè)Q一套移液器。移除內部所有物品，用ＤＮＡ去除劑擦拭表面后，打開(kāi)柜門(mén)連續運行。用ＤＮＡ去除劑擦拭內表面后，打開(kāi)提取儀門(mén)或外罩，靜置。如果能及時(shí)發(fā)現污染，通常情況不會(huì )太嚴重，采取上述措施實(shí)驗室空置幾天污染會(huì )消除。但是如果發(fā)生了很?chē)乐氐奈廴?，采取上述措施污染仍不能消除，就只能把一切交給時(shí)間了。
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